分子生物学实验室基本流程

本文记录了分子生物学实验室的基本操作流程，包括质粒构建、细菌转化、细胞转染及 PCR 鉴定等步骤。

一、质粒构建与细菌操作

1. 设计

设计相应效用的质粒，并确立切割、连接方案。（原则：尽量用已有质粒）

2. 摇菌

1. 配比：15ml LB + 30μL AMP（比例 500：1）。
2. 接种：枪头蘸取对应甘油菌（30% 的甘油 + 对应菌）。

3. 提取质粒

1. 公用高速离心机离心成菌沉 10min X 12000g。
2. LB 培养基倒专属瓶子，加入泡腾片后倒入水道。
3. 根据试剂盒说明书加入P1或E1等试剂，具体看说明书，不同菌有不同处理方式

4. 切割（若有）

1. 确立切割酶的最佳效用时间和活性 Buffer。
2. 体系配比（4x体系）：
   • DNA：XXX ng
   • Buffer：5 × 4 μL
   • 切割酶：4 μL
   • ddH2O：补至 50 μL
3. PCR 仪培育切割（先根据NEB的数据库设计酶切时长和温度，酶切结束后放入4℃冰箱保存）。

5. 跑胶与回收

1. 0.6% / 0.8% / 1% 琼脂糖凝胶，1.5 μL 染料。💡 跑胶示例
2. 切割回收。
   （1）取1.5ml或2ml离心管称重，记录空管重量
   注：从这一步开始，按试剂盒的说明书进行，以下为其中一种方案
   （2）将电泳分离后的凝胶放在紫外灯下，快速切下含有目的DNA片段的凝胶，并尽可能去除多余的凝胶
   （3）称取凝胶块的重量，并转移至上述1.5ml或2ml离心管中，按100mg凝胶块相当于100μL体积计算，加入1 ~ 1.5倍体积Buffer GDP，50 ~ 60℃水浴10 ~ 15min，让凝胶块完全溶解。水浴期间，颠倒混匀3次加速溶解
   （4）短暂离心收集管壁上的液滴，将HiPure DNA Mini Column I 套在收集管中，把≤700μL转移至柱子（即HiPure DNA Mini Column I）中。12000xg离心60s
   （5）（可选：溶胶液超过700μL，即有剩余溶液）倒弃滤液，把柱子套回收集管中，把剩余溶胶液转移至柱子中。12000xg离心60s
   （6）倒弃滤液，把柱子套回收集管中。加入600μLBuffer DW2（已用无水乙醇稀释）至柱子中。12000xg离心60s
   （7）倒弃滤液，把柱子套回收集管中。加入300μLBuffer DW2（已用无水乙醇稀释）至柱子中。12000xg离心2min
   （8）把柱子套在1.5ml离心管中，加入15 ~ 30μL Elution Buffer至柱子膜中央。放置2min。12000xg离心1min💡 如果要获得最高产量需要重复洗脱
   （9）丢弃柱子，将DNA保存在-20℃冰箱

6. 转化细胞

1. 转化体系（配制后室温 10min 或 16℃ 过夜）：
   • 载体：50 ng
   • 片段：50 ng（双酶切片段）
   • 10x T4 buffer：1 μL
   • T4 连接酶：1 μL
   • ddH2O：补至 10 μL
2. 同时，感受态细胞取出，10min 冰上待用。
3. 预热水浴锅、取出 SOC 培养基。
4. 取 50 μL 感受态细胞 + 5 μL 转化体系，10min 冰上待用。（剩余 5 μL 转化体系转至 16℃ 保温，最多 24h，之后转入 -20℃ 保存或丢弃。）
5. 热激：42℃ 水浴 45s，随后 2min 冰上待用。
6. 超净台操作：加 200 μL SOC。
7. 复苏：取出培养皿，后一起放于摇床（DH5α 细胞 37℃ 1h，stbl3 细胞 30℃ 1.5h）。

7. 涂板

分 150 μL、50 μL 规格，涂板结束后倒置放入摇床 37℃，20h。

8. 划菌

准备 3 个 14ml 摇菌管（每管加 3ml LB，剩余保存常温），同样配比。

9. 摇床培养

37℃，16h。如果在挑菌时打入了挑菌用的枪头

10. 保菌

• 1.5ml 保存管：甘油 500 μL + 菌液 500 μL， -80℃ 保存。
• 2ml 管：全倒，标记 TDGH 1-3。

11. 质粒提取

2ml 菌液，13000g 离心 10min（2次），进行小提小量， -20℃ 保存。
此处请根据说明书protocol进行操作
🧪 1~5ml 质粒小提小量步骤

🧪 10~15ml 质粒小提中量步骤

12. 鉴定

（此处进行酶切或 PCR 鉴定）

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二、细胞实验操作

细胞培养相关培养基配方

配方	用途	每500mL DMEM (添加量)
无FBS（- - -）	瞬转
3% FBS, 1% NEAA, 1% Ab（+++ 3%）	半换液	15mL FBS, 5mL NEAA, 5mL Ab
10% FBS, 1% NEAA, 1% Ab（+++ 10%）	传代	50mL FBS, 5mL NEAA, 5mL Ab
10% FBS, 1% NEAA, 0% Ab（++ 10%）	收细胞，铺板	50mL FBS, 5mL NEAA, 0mL Ab

复苏细胞

1. 从液氮罐中取出细胞冻存管（Cryovial），放入预先准备好的水浴锅的水的罐子中，迅速转移到细胞房内。
2. 将细胞转移到含有10 ml预热的++DMEM 培养基的15 ml 离心管中，离心1000RPM 5min
3. 取6 mL DMEM 培养基（+++）到T25培养瓶中，等待离心结束
4. 丢弃上清液，保留沉淀，用 2 ml DMEM 培养基（+++）重悬细胞沉淀，将重悬液转移到上述T25培养瓶中
5. 写好细胞名称，代数（P1），日期，实验员

细胞传代

+++10%培养基预热
取3x5ml移液管：

1. 抽出旧培养基
2. 伸到底部加入5ml的DPBS，十字摇晃，抽走DPBS
3. 新培养瓶加入4.5ml培养基，移液管留着
4. 加入300μL的TP蛋白酶，细胞大面积脱落后加5ml培养基终止反应，得细胞悬液
5. 移液枪转移0.5ml细胞悬液到新培养瓶

细胞冻存

准备+++10%培养基，FBS胎牛血清，DMSO

按照以下比例配冻存液

溶液	比例
+++10%培养基	70%
FBS胎牛血清	20%
DMSO（最后加入）	10%

混合+++10%培养基和FBS胎牛血清，在第9步加入DMSO
一般情况下，在细胞传代时，将旧的细胞悬液直接冻存

1. 抽出旧培养基
2. 伸到底部加入5ml的DPBS，十字摇晃，抽走DPBS
3. 新培养瓶加入4.5ml培养基，移液管留着
4. 加入TP蛋白酶，细胞大面积脱落后加5ml培养基终止反应，得细胞悬液
5. 移液枪转移0.5ml细胞悬液到新培养瓶

从一步开始，与细胞传代不同
6. 将旧培养瓶中剩余的细胞悬液全部转移到15ml离心管中
7. 离心1000rpm 5min，去掉上清液
8. 用 +++10%培养基和FBS胎牛血清 混合液重悬细胞沉淀
9. 按比例（10%）加入DMSO，混匀，按1ml/管分装到冻存管中
10. 放在-80℃冰箱中过夜，第二天转移到液氮中保存

1. 铺板

耗材：3x5ml移液管，1x25ml移液管
预热++10%培养基

1. 用一支5ml移液管抽取旧培养基，丢弃到废液缸
2. 伸到底部加入5ml的DPBS缓冲液，十字摇晃，抽走DPBS
3. 加入300ml的TP蛋白酶，细胞脱落后转移到50ml离心管💡 提示
4. 根据需要铺板的点样数计算培养基的用量，用25ml移液管往50ml离心管中加入培养基，吹打混匀💡 计算示例
5. 500 μL/孔，每加完一列重新吹打一下。
6. 稍微摇荡均匀，保鲜膜封膜后，再次拍打均匀。
7. 细胞长至80% ，进入转染。

2. 转染

缩写说明：

• FBS: 胎牛血清
• NEAA: 非必需氨基酸
• Ab: 抗体

1. 调浓度设计，浓度要求误差小于 0.5，且跑胶确认 1 μL。💡 计算示例
2. A、B 液设计。💡 A液计算示例
3. A + B 混合10分钟室温。
4. 加入细胞转染。
5. 16h 换液：脚踏吸取，润洗上下通道后十分缓慢加入。
   • 选择抗性：blast、puro、zeocin
   • 抗性浓度：10 μg/mL（blast）

3. 收细胞

1. 脚踏吸液，一般吸去上层。
2. 加入 500 μL DPBS，直接吹打直至细胞全部脱落。💡 观察技巧
3. 转移至 1.5ml 离心管，离心5000rpm 5min。
4. 脚踏吸液，至吸光（不要吸走细胞团）。
5. 加入 500 μL DPBS，震荡 15s 重悬。
6. 离心5000rpm 5min ，吸取至吸光（不要吸走细胞团）。

---

三、PCR 鉴定与测序

1. lysis（裂解液） 处理

1. 用 25~30 μL 裂解液 重悬细胞团。
2. 转移至八联管，PCR 程序见 PCR 仪器。

2. 一轮 PCR

1. 扩增体系： PCR（引物根据位点选择，注意加入水空白组，注意不要吸取到细胞）。
   鉴定PCR（实际情况根据protocol调整）：

   溶液	μL
   buffer	12.5
   fw上游引物	0.5
   rv下游引物	0.5
   dNTP	0.5
   Taq酶	0.5
   template模板	2
   水	8.5

2. 扩增程序：常见 56℃/58℃ 退火，延伸 15~20s。

3. 用 5 μL 跑胶，剩余 20 μL 按纯化表格混合。💡 如果发现条带比较暗，可以使用套扩

4. 磁珠纯化：使用前室温恢复 30min，吹打混匀，预热 ddH2O，10 μL 一个 sample。
   📝 DNA 磁珠纯化完整步骤

5. 测浓度，取部分调至 15 ng/μL，取 10 μL。

3. 二轮 PCR

1. 扩增体系：普通 PCR，扩增引物不同（引物通用 p2A-fw，rv 根据 index），注意加入水作为空白组。
2. 扩增程序：与一轮一致。
3. 用 5 μL 跑胶鉴定，按纯化表格再次混合合并二轮产物。
4. 送测，订单表格 + 纯化表格，泡沫箱 + 冰袋封装。

四、数据分析

使用CRISPResso2，以docker部署为例，配合 powershell 7 使用

powershell 7可以并行运算，一定程度上提高了在Windows系统下的计算效率，加快分析速度

以下示例代码使用site_info插入.csv和site_info删除.csv，都带上了--discard_indel_reads参数

# 强制 PowerShell UTF-8
[Console]::InputEncoding  = [System.Text.UTF8Encoding]::new()
[Console]::OutputEncoding = [System.Text.UTF8Encoding]::new()
$PSDefaultParameterValues['Out-File:Encoding'] = 'utf8'


# ================= 配置区域 =================
$CurrentDir = $PWD.Path

# fastq-multx 镜像
$MultxImage = "quay.io/biocontainers/fastq-multx:1.4.2--h9948957_5"
$CrispressoImage = "pinellolab/crispresso2:latest"

# ================= 两套运行配置 =================
$RunConfigs = @(
    @{
        Name = "位点插入3bp带discard"
        Csv  = "site_info插入.csv"
        UseDiscard = $true
    },
    @{
        Name = "位点删除3bp带discard"
        Csv  = "site_info删除.csv"
        UseDiscard = $true
    }
)

# ================= 读取 CSV =================
$AllRunInfo = @{}

foreach ($cfg in $RunConfigs) {
    $csvPath = Join-Path $CurrentDir $cfg.Csv
    if (-not (Test-Path $csvPath)) {
        Write-Error "找不到 CSV: $($cfg.Csv)"
        exit
    }
    
    # 读取配置
    $sites = Import-Csv -Path $csvPath -Header "Site","Guide","Amp","Len","Type","HDR"
    
    $AllRunInfo[$cfg.Name] = @{
        Sites = $sites
        UseDiscard = $cfg.UseDiscard
    }
}

# ================= 扫描样本文件夹 =================
# 采用文件夹扫描模式（与之前成功的逻辑保持一致），确保能找到成对的R1/R2
Write-Host "扫描样本文件夹..." -ForegroundColor Cyan
$Tasks = @()

# 要排除的固定目录
$ExcludeFolders = @("空白", "替换")

Get-ChildItem -Directory | ForEach-Object {
    $folderName = $_.Name

    # 排除输出目录 + 空白 / 替换
    if (
        ($folderName -notin $RunConfigs.Name) -and
        ($folderName -notin $ExcludeFolders)
    ) {
        $r1 = Get-ChildItem $_.FullName -Recurse -Filter "*_R1*" |
              Where-Object { $_.Name -match "fastq\.gz|fq\.gz" } |
              Select-Object -First 1
        
        if ($r1) {
            $Tasks += [PSCustomObject]@{
                FolderName = $folderName
                R1File     = $r1
            }
        }
    }
}

Write-Host "共找到 $($Tasks.Count) 个样本。" -ForegroundColor Green

# ================= 并行执行 =================
$ThreadCount = 2
Write-Host "开始运行 fastq-multx + CRISPResso (HDR 模式)..." -ForegroundColor Cyan

$Tasks | ForEach-Object -Parallel {

    $task = $_
    $base_dir = $using:CurrentDir
    $multx    = $using:MultxImage
    $crispresso = $using:CrispressoImage
    $runinfo  = $using:AllRunInfo

    # 路径处理
    $r1Full = $task.R1File.FullName
    $r2Full = $r1Full -replace "_R1","_R2"
    if (-not (Test-Path $r2Full)) { return }

    # 转为 Docker 相对路径
    $r1Rel = $r1Full.Substring($base_dir.Length+1) -replace '\\','/'
    $r2Rel = $r2Full.Substring($base_dir.Length+1) -replace '\\','/'
    $sample = $task.FolderName

    foreach ($modeName in $runinfo.Keys) {

        $cfg = $runinfo[$modeName]
        $sites = $cfg.Sites
        $useDiscard = $cfg.UseDiscard

        # 1. 准备目录结构
        # RawData: 放在 模式/RawData/样本名
        $rawOutRel = "$modeName/RawData/$sample"
        $rawOutFull = Join-Path $base_dir $rawOutRel
        if (-not (Test-Path $rawOutFull)) { New-Item -ItemType Directory -Path $rawOutFull -Force | Out-Null }
        
        # 结果目录: 预先创建位点文件夹
        foreach ($s in $sites) {
            $siteResDir = Join-Path $base_dir "$modeName/$($s.Site)"
            if (-not (Test-Path $siteResDir)) { New-Item -ItemType Directory -Path $siteResDir -Force | Out-Null }
        }

        # 日志文件
        $logFile = Join-Path $rawOutFull "process_log.txt"

        # 2. 生成 Barcode 文件 (针对当前位点列表)
        $bcFileName = "barcodes_${sample}_${modeName}.txt"
        $bcFilePath = Join-Path $base_dir $bcFileName
        $bcContent = @()
        foreach ($row in $sites) {
            if ($row.Site -and $row.Amp.Length -ge 10) {
                $bcContent += "$($row.Site)`t$($row.Amp.Substring(0,10))"
            }
        }
        $bcContent | Out-File -Encoding ascii $bcFilePath

        Write-Host ">>> [$sample][$modeName] 正在拆分数据..." -ForegroundColor Magenta

        # 3. 运行 fastq-multx
        docker run --rm -v "${base_dir}:/Data" -w /Data $multx `
            fastq-multx -B "/Data/$bcFileName" -m 1 -b `
            "/Data/$r1Rel" "/Data/$r2Rel" `
            -o "/Data/$rawOutRel/%.R1.fastq" `
            -o "/Data/$rawOutRel/%.R2.fastq" 2>>$logFile

        # 4. 运行 CRISPResso
        foreach ($site in $sites) {
            if (-not $site.Site) { continue }

            # 检查拆分文件是否存在
            $siteR1 = Join-Path $rawOutFull "$($site.Site).R1.fastq"
            
            if (Test-Path $siteR1) {
                Write-Host "    -> CRISPResso: $($site.Site) (Discard: $useDiscard)" -ForegroundColor Gray

                # --- 构建参数数组 (修复空参数BUG) ---
                $dockerArgs = @(
                    "run", "--rm",
                    "-v", "${base_dir}:/Data", "-w", "/Data",
                    $crispresso,
                    "CRISPResso",
                    # 使用拆分后的数据 (修复原代码逻辑错误)
                    "--fastq_r1", "$rawOutRel/$($site.Site).R1.fastq",
                    "--fastq_r2", "$rawOutRel/$($site.Site).R2.fastq",
                    
                    # 输出目录指向位点层级，自动生成 Sample 文件夹
                    "--output_folder", "/Data/$modeName/$($site.Site)",
                    
                    "-n", $sample,
                    "-an", $site.Site,
                    "--amplicon_seq", "$($site.Amp)",
                    "--guide_seq", "$($site.Guide)",
                    "--expected_hdr_amplicon_seq", "$($site.HDR)",
                    
                    # 保留你要求的特定参数
                    "--quantification_window_size", "20",
                    "--quantification_window_center", "-3",
                    "-q", "30",
                    "--plot_window_size", "40",
                    "--exclude_bp_from_left", "0",
                    "--exclude_bp_from_right", "0"
                )

                # 条件添加 discard
                if ($useDiscard) {
                    $dockerArgs += "--discard_indel_reads"
                }

                # 执行并记录日志
                & docker $dockerArgs 2>>$logFile
            }
        }
        
        # 清理临时 barcode
        Remove-Item $bcFilePath -ErrorAction SilentlyContinue
    }

    Write-Host "[$sample] 全部完成" -ForegroundColor Yellow

} -ThrottleLimit $ThreadCount

Write-Host "所有任务处理完毕" -ForegroundColor Cyan

然而，一般来说使用的是Linux服务器进行运算，所以此处仅作为参考

五、慢病毒生产 (Lentivirus Production)

1. 铺板 (Day 1)

• 进行细胞铺板。（注：进化实验从 P1 开始）。

2. 转染 (Day 2)

• Mix A 配置（DNA + Opti-MEM）：

  • LV 载体质粒：$1.64 \mu g$ (或 $2 \mu g$)
  • PAX2 包装质粒：$1.3 \mu g$ (或 $1.5 \mu g$)
  • VSV-G 包膜质粒：$0.72 \mu g$ (或 $0.5 \mu g$)
  • 质粒比例约为 4:3:1，总质粒量 $4 \mu g$（对应 $4 \mu l$）。
  • 加入 Opti-MEM 补齐至 $250 \mu l$。
  • 室温静置 5 min。
  • *(小贴士：可以先计算 250 μl 减去各质粒的体积，加入 Opti-MEM 后，再依次加入 LV、PAX2 和 VSV-G 质粒)*。

• Mix B 配置（脂质体 + Opti-MEM）：

  • Lipofectamine 2000：$12 \mu l$ (适用于 6 孔板体系)
  • Opti-MEM：$250 \mu l$

• 混合转染液：

  • 将 Mix B 加入 Mix A 中（或 A 加入 B），室温孵育 10-15 min（最长可至 20 min）。
  • 小心将混合物 ($250 \mu l + 250 \mu l = 500 \mu l$) 逐滴加入含有细胞的孔中。确保最终体系总量一致（例如加入到已有 $1500 \mu l$ 培养基的孔中，总体积为 $2000 \mu l$）。

3. 换液 (Day 3)

• 转染后 12h 左右（8-16h） 进行换液。
• 换为 Opti-MEM（可选择性加入抗生素）。
• 换液体积：24孔板加 $500 \mu l$，6孔板加 $2000 \mu l$。注意：需沿孔壁缓慢加入，避免冲起细胞。

4. 病毒收集 (Day 4)

1. 收集培养上清液。
2. 低速离心去除残留细胞（1500 rpm, 5 min）。
3. 将上清液转移至新的无菌管中。
4. 使用 $0.45 \mu m$ 滤膜进行过滤。
5. 分装病毒液，保存于 -80℃ 冰箱。

---

六、细胞稳转株的筛选与维持 (Cell Stable Transfection)

1. 病毒制备与收集（简述）

• 293T 细胞密度在 70-80% 时使用 Lipo 2000 进行转染（通常 1 个培养皿或 3 个 6 孔板）。
• 孵育 4-6h 后更换完全培养基。
• 转染后 48-72h 收集上清（6孔板每孔收 $2000 \mu l$），用 $0.45 \mu m$ 滤膜过滤去除细胞。收集后可直接用于感染或 -80℃ 保存。（注：需要时可将 $6 ml$ 原液以 1:50 进行浓缩）。

2. 慢病毒感染及稳转株筛选

1. 铺板与感染：将目标细胞种植在多孔板（如 24 孔板，4×4 布局）中。待细胞密度达到 70-80% 时，梯度加入病毒液。
2. 加药筛选：感染 24h 后换液，加入含对应抗生素的培养基。
   • Hygro：通常从 $200 \mu g/ml$ 起（梯度：50, 100, 200）。
3. 代系维持：培养三代，逐步提高抗生素浓度。选用病毒梯度较低且细胞存活状态良好的孔进行后续实验。
   • Hygro 筛选梯度：100 -> 200 -> 500 (最高)
   • Blast 筛选梯度：1 -> 5 -> 10 -> 20 -> 50 (最高)
4. 冻存：完成筛选后进行细胞冻存。

---

七、进化实验 (Evolution Experiment)

1. 转染突变质粒 (R1)

• 更换宿主细胞系，进行铺板（使用 24 孔或 12 孔板）。

• 转染体系（以 24 孔板扩增至 12 孔板为例，设立 2 个复孔）：

  • Mix A: Pro mix ($750 ng$) + gRNA mix ($250 ng$) + Opti-MEM = $50 \mu l$ (单孔用量)
  • Mix B: Lipo 2000 ($3 \mu l$) + Opti-MEM ($47 \mu l$) = $50 \mu l$ (单孔用量)

• 转染 4-6h 后，充分换液，换为含 Zeocin 的培养基。

  • 24孔板：1000 μl；12孔板：2000 μl。
  • Zeocin 浓度范围 50-400 μg/ml。R1 阶段通常为 50 μg/ml。
  • 进化后期（Rn）若细胞耐受（几乎不死），可将浓度提高至 100 -> 200 μg/ml。

2. 转染筛选质粒 (R1 筛选)

• 转染体系（12 孔板）：
  • A: Selection plasmid + Opti-MEM
  • B: Lipo + Opti-MEM
• 操作与分组筛选：
  • 转染前，将 24 孔板的细胞消化，转移到离心管中离心，加入含抗生素的培养基重悬，然后铺至 12 孔板进行筛选。
  • 离心参数及分装参考：6孔板 $2 ml$，12孔板 $1 ml$。
• 加药换液：
  • 转染后 24h 换液并加入抗生素。设置 2-3 组 Puro 浓度梯度（如 0.5, 1, 2 $\mu g/ml$）。
  • （注：稀释抗生素时，可按最大浓度的 2 倍体积配比，方便进行梯度稀释）。
• 持续观察：
  • 48h 后，吸尽含抗生素的旧培养基，充分换液（$1000 \mu l$）。
  • 持续吸走死亡细胞并换液。
  • 当观察到孔内出现 1/3 或 1/4 岛状细胞团时，即可消化铺板，进入下一轮 (R2) 进化实验。